組織研磨機(jī)對提取小鼠尾巴RNA的實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)步驟

1、首先將上海凈信的組織研磨機(jī)上的制冷模塊預(yù)先置于-20℃，使用時取出安裝好。將研磨珠去RNA酶處理。

2、隨機(jī)抽取小鼠的尾巴100µg，把樣本剪成盡可能小段，置于無RNA酶的2研磨單位離心管中（選擇耐液氮冷凍管子），同時加入1顆5號研磨珠和2顆3號研磨珠（如果選擇1.5研磨單位離心管，只需要加入4-5顆3號研磨珠）。

3、放置于液氮中一起浸泡3分鐘，取出放置于預(yù)冷模塊中，在全自動樣品研磨儀上選擇13單位頻振研磨60s。（該步驟可以根據(jù)研磨的細(xì)微程度要求可以再重復(fù)一遍）

4、把研磨好的樣本加入0.06ml的PBS0.14ml的RNAiso Plus（此處選擇PBS，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入其他提取液，如1ml TRIzol等），繼續(xù)置于研磨機(jī)上選擇13單位頻振研磨60s。樣本將處于糊狀。（其他提取試劑有可能會出現(xiàn)泡沫，不影響實(shí)驗(yàn)）

5、取出研磨管，放入冷凍離心機(jī)中，于4度，12000g離心10分鐘

6、小心吸取上清液0.1ml至新的1.5研磨單位離心管中，蓋上管蓋，在室溫上孵育15分種，使樣品充分裂解至勻漿液較透明，如果仍有少量顆粒屬于正常情況，不影響RNA提取質(zhì)量和得率。

7、在1.5研磨單位離心管中加入0.02ml，蓋緊管蓋，振蕩混勻并將其在冰上孵育15分種，于4度，12000g離心15分鐘。離心后混合物分層：上清層，中間層，下層；RNA存在于上清層中。

8、將上清層小心轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中，加入等體積冰浴的異丙醇，顛倒振蕩混勻，將混合的樣品在-20度條件，孵育20分種，于4度，12000g離心10分鐘。RNA沉淀通常形成片狀沉淀附著于管壁或管底。

小心棄去上清，用1ML的冰浴75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，顛倒洗滌離心管管壁，并旋渦振蕩樣品，盡可能讓沉懸浮，于4度，12000g離心5分鐘，再次去除上清，晾干沉淀。

10、操作的后，在陰涼處適度干燥RNA沉淀（避免過分干燥，那樣會降底它的可溶性）。

11、用適量（一般可用0.01—0.02ml）的無RNA酶水或TE溶液來溶解RNA。抽提好的RNA，保存于-70度。