活細(xì)胞骨架染色中的應(yīng)用

Actin-肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架*的一個(gè)組成部分，其在很多基礎(chǔ)的細(xì)胞活動(dòng)中扮演著非常重要的角色。尤其在細(xì)胞形態(tài)，遷移和研究細(xì)胞機(jī)制中，肌動(dòng)蛋白都是一個(gè)非常理想的觀(guān)測(cè)蛋白。肌動(dòng)蛋白是由小球狀的G-actin聚合成絲狀的F-actin動(dòng)態(tài)交互變化構(gòu)成的，從而參與了細(xì)胞活動(dòng)中的各種細(xì)胞骨架的變化。通常研究活細(xì)胞中actin的活動(dòng)用的是轉(zhuǎn)染actin-GFP融合蛋白的質(zhì)粒，可以同時(shí)標(biāo)記F-actin和G-actin，可以有效的反映出細(xì)胞骨架的相對(duì)活性，但是當(dāng)值需要觀(guān)測(cè)F-actin的時(shí)候，使用actin-GFP會(huì)降低信噪比，難以專(zhuān)一捕捉F-actin的活動(dòng)。更有研究顯示，使用actin-GFP會(huì)直接影響細(xì)胞遷移和細(xì)胞分裂中的肌動(dòng)蛋白活性。

2015年英國(guó)的科研人員研究了幾種可以標(biāo)記F-actin染料發(fā)現(xiàn)LifeAct是一種觀(guān)測(cè)F-actin非常理想的染料，其能特異性結(jié)合F-actin而不會(huì)影響肌動(dòng)蛋白的活性，能夠很好的顯現(xiàn)出肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)。LifeAct是一個(gè)17個(gè)氨基酸形成短肽，由于其很小，不會(huì)被哺乳動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)作外來(lái)蛋白清除，從而使一個(gè)非常理想的F-actin標(biāo)記物。文中，以人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs， Human mesenchymal stem cells）為載體，研究LifeAct-GFP對(duì)比actin-GFP在觀(guān)測(cè)肌動(dòng)蛋白中的應(yīng)用。

Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration

K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight

Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034

（一）實(shí)驗(yàn)材料

• 細(xì)胞:     hMSCs            （STEMCELL Technologies，UK）
• 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質(zhì)粒    （ibidi， Germany）

             DMEM             （Gibco）

             Actin-GFP

             Lipofetamine LTX Plus     (Invitrogen)

             4%多聚甲醛溶液

             0.5%Triton X-100

  3) 耗材：玻璃管（外徑1mm，內(nèi)徑0.58mm）

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

  1、LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染

• 使用未分化的hMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染actin-GFP質(zhì)粒。
• 無(wú)抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培養(yǎng)細(xì)胞30min到1h
• 使用Lipofetamine LTX Plus轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，按照說(shuō)明書(shū)將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)。
• 使用未分化的hMSCs細(xì)胞和，hMSCs細(xì)胞分化的永生化軟骨細(xì)胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺病毒。

2、固定細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)

使用Alexa Flour555-phalloidin標(biāo)記F-actin

• 單層細(xì)胞貼壁染色，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。
• 懸浮細(xì)胞染色，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化為單細(xì)胞，再在懸浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。

3、微管吸吮技術(shù)

• 將外徑1mm，內(nèi)徑0.58mm玻璃管拉為內(nèi)徑7-8μm的微管
• 使用注射泵維持微管內(nèi)有0.76kPa的負(fù)壓
• 輕輕吸取細(xì)胞，每2秒采集一張圖片
• 細(xì)胞在微管負(fù)壓情況下會(huì)有不規(guī)則的突起，進(jìn)入微管，能很好的觀(guān)測(cè)F-actin的活動(dòng)。

• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染共定位（圖一）

圖一：鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染共定位：A、E）貼壁細(xì)胞中，LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在標(biāo)記F-actin時(shí)都表現(xiàn)很好，但是在懸浮細(xì)胞中，C、G）雖然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼筆環(huán)肽都能共定位F-actin，但是actin-GFP在整個(gè)細(xì)胞中都有染色，因?yàn)槠渫瑫r(shí)染G-actin沒(méi)有凸顯出F-actin。

2、微管吸吮技術(shù)使細(xì)胞發(fā)生形變，觀(guān)察F-actin活動(dòng)（圖二）

圖二：微管吸吮技術(shù)造成細(xì)胞形變。A）LifeAct-GFP可以很好的追蹤F-actin，會(huì)根據(jù)細(xì)胞的形變，標(biāo)記到細(xì)胞突起的外緣的骨架；B）使用Actin-GFP標(biāo)記沒(méi)有特異性，不能看到細(xì)胞變形中邊緣的骨架。