ibidi科普知識系列|血管生成實驗小常識

　　1、哪種細(xì)胞密度適合應(yīng)用實驗　

　　通常，我們建議每孔使用5,000-10,000個HUVEC。 但是，確定最佳細(xì)胞數(shù)對于使用µ-Slide血管生成從管形成測定中獲得最佳結(jié)果是至關(guān)重要。 細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞大小。 因此，在開始實際實驗之前，我們建議在非抑制條件下播種幾個細(xì)胞數(shù)并對管形成進(jìn)行成像。 然后，對于最佳測定條件，使用在您的實驗中產(chǎn)生最多管數(shù)的細(xì)胞密度。請記住，細(xì)胞通常不會在凝膠基質(zhì)上增殖。請參閱：血管生成實驗實驗裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi µ-Slide

　　2、應(yīng)該在哪個時間段內(nèi)觀察細(xì)胞　　

　　管形成的持續(xù)時間取決于細(xì)胞類型和所使用的細(xì)胞外基質(zhì)，應(yīng)單獨確定。 通常，HUVEC在 2-4小時后已經(jīng)形成管。24小時后細(xì)胞開始發(fā)生凋亡，這導(dǎo)致從基質(zhì)中脫離和管破裂。請參閱：血管生成實驗實驗裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi µ-Slide

　　3、是否需要活細(xì)胞成像裝置來每小時拍攝管形成測定的照片　

　　非必須，通過顯微鏡對 µ-Slide 血管生成上的同一位置進(jìn)行一致和精確的成像。 可以使用顯示 x/y 坐標(biāo)的顯微鏡載物臺或自動載物臺來完成成像。 使用自動化平臺，可以將孔的所有位置（特別是每個孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每個時間點訪問相應(yīng)的位置。

　　但是，使用完整的活細(xì)胞成像設(shè)置在顯微鏡上建立生理條件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系統(tǒng)等活細(xì)胞孵育裝置有助于在成像過程中提供穩(wěn)定溫度和濕度條件，從而在體外可以直接進(jìn)行視頻拍攝。

　　4、是否可以使用 µ-Slide 血管生成在凝膠基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞　　

　　可以，µ-Slide 血管生成非常適合在精確定義的3D基質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞。由于大界面的凝膠和頂部細(xì)胞培養(yǎng)基，凝膠中的條件可以通過更換上部儲液器中的介質(zhì)來調(diào)整。

　　5、應(yīng)該在管形成實驗中使用含酚紅的凝膠還是不含酚紅的凝膠　　

　　對于使用µ-Slide血管生成的管形成測定中的相差顯微鏡，酚紅不會干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。然而，當(dāng)使用熒光顯微鏡時，酚紅可能會干擾探頭的波長。在這種情況下，最好使用無酚紅凝膠。

　　6、是否需要將µ-Slide Angiogenesis血管生成載玻片放入培養(yǎng)箱的濕室中進(jìn)行凝膠聚合

　　我們建議將µ-Slide血管生成載玻片放入加濕腔中進(jìn)行凝膠聚合。 雖然反應(yīng)室對于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地減少蒸發(fā)的影響。 在高流量孵化器中，防止蒸發(fā)的足夠百分比的濕度可能不會始終保持一致。 µ-Slide血管生成中的少量凝膠會很快變干，這會導(dǎo)致彎液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 濃度是否會影響管形成實驗中的管形成和降解速率　　

　　一般是的。 這取決于所使用的細(xì)胞類型或細(xì)胞系。 當(dāng)提供濃度高達(dá) 10% FCS 的細(xì)胞培養(yǎng)基時，我們在 µ-Slide 血管生成中觀察到典型的原代細(xì)胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的幾種內(nèi)皮細(xì)胞系。 但是，我們建議分別優(yōu)化每個細(xì)胞系的 FBS/FCS 濃度。

　　8、您是否推薦使用減少生長因子的 Matrigel® 進(jìn)行管形成分析　

　　對于使用µ-Slide血管生成的管形成測定，我們使用了減少生長因子的 Matrigel® 和未減少的 Matrigel®。

　　9、我們希望使用減少了生長因子的 Matrigel® 和無血清培養(yǎng)基以及 50 ng/ml VEGF。 這足以刺激管的形成嗎　　

　　可以，這種組合足以刺激ibidi血管生成實驗室器皿中的管形成，而培養(yǎng)基中沒有任何額外的生長因子。

　　10、除了 Matrigel® 之外，您在試管形成實驗中是否有使用其他凝膠的經(jīng)驗　　

　　原則上，任何凝膠都可用于µ-Slide血管生成管形成實驗。 細(xì)胞可以附著在表面上是很重要的。 膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白為細(xì)胞粘附提供了重要的結(jié)合基序。

　　11、什么是管形成實驗合適的陽性和陰性對照　　

　　建議使用陽性和陰性對照來減少管形成實驗中的變量。陽性對照是預(yù)期細(xì)胞在其中形成血管的樣本（取決于實驗設(shè)置），從而向研究人員表明該實驗已正確進(jìn)行。陰性對照是與所有其他樣品以相同方式處理的樣品，但預(yù)計不會顯示任何實驗結(jié)果（例如，很少或沒有管形成）。

　　ibidi血管生成實驗室器皿中管形成實驗的最佳陽性和陰性對照很大程度上取決于所使用的細(xì)胞、凝膠基質(zhì)和一般實驗設(shè)置。因此，我們建議您查閱文獻(xiàn)，了解您感興趣的主題中成功使用的對照（陽性和陰性對照）。

　　在下文中，您可以找到管形成測定中陽性和陰性對照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物誘導(dǎo)血管生成的效力，則可以使用用已知血管生成誘導(dǎo)劑（例如 VEGF 或 FGF2）處理的樣品作為陽性對照。濃度很大程度上取決于細(xì)胞類型和實驗設(shè)置。

　　如果使用原代細(xì)胞，預(yù)篩選的內(nèi)皮細(xì)胞系（例如，HUVEC）在用特定生長因子處理后表現(xiàn)出明確的反應(yīng)，可以作為陽性對照。

　　對于某些細(xì)胞類型，形成管的能力還取決于所使用的凝膠基質(zhì)。作為陽性對照，內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)在含有饑餓培養(yǎng)基（不含生長因子或血清的培養(yǎng)基）的生長因子減少的 Matrigel®上顯示管形成。如果需要測試促血管生成物質(zhì)，則使用饑餓培養(yǎng)基尤其重要，因為大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都添加了生長因子。為了分析物質(zhì)的真實效果，基質(zhì)和培養(yǎng)基都必須不含任何生長因子。作為陰性對照，細(xì)胞可以播種在不同的基質(zhì)（例如膠原蛋白 I）上，預(yù)計不會形成管狀。

　　不影響細(xì)胞活力的管形成抑制劑（例如，蘇拉明或蘿卜硫素）可用作陰性對照。如果實驗的目的是測試抗血管生成物質(zhì)，則使用這種類型的抑制劑尤其重要。

　　如果用任何溶解的物質(zhì)（例如，在 DMSO 或乙醇中）處理細(xì)胞，則僅使用溶劑作為陰性對照。

　　12、是否有用于分析管形成實驗的推薦染色方案　

　　一般來說，相差顯微鏡足以自動分析 µ-Slide血管生成中的標(biāo)準(zhǔn)管形成實驗。 但是，如果您想研究某種標(biāo)記，您可以應(yīng)用您的標(biāo)準(zhǔn)方案（例如，用于免疫熒光染色），但要小心，以免損壞凝膠基質(zhì)或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

　　13、在開始實驗之前，我是否必須將 ibidi 血管生成實驗室器皿平衡到 37°C　　

　　不，不需要平衡 µ-Slide 血管生成。 在室溫下儲存，可以立即用凝膠基質(zhì)填充。 由于µ-Slide 的開孔形式，加熱時從凝膠中逸出的氣體可以與大氣自由交換。

　　14、完成實驗后，µ-Slide Angiogenesis和µ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重復(fù)使用嗎　

　　不可以，µ-Slide血管生成載玻片和µ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，僅供一次性使用。

　　15、µ-Slide 血管生成是否有96孔版的　

　　有。 µ-Plate血管生成96孔板具有與µ-Slide血管生成相同的“孔中孔"設(shè)計和凝膠體積 (10 µl)。 µ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成實驗的篩選板，具有*的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性