3D細(xì)胞培養(yǎng)--子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞eSCs和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞

Eph和ephrin蛋白在協(xié)調(diào)細(xì)胞、細(xì)胞導(dǎo)向、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用中發(fā)揮著非常重要的作用，與發(fā)展的組織模式和器官和血管生成都有關(guān)系。Eph家族成員在人類腫瘤的發(fā)展過程中有著非常關(guān)鍵功能，在正常的子宮內(nèi)膜的血管化再生組織和人子宮內(nèi)膜具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSC）有能檢測(cè)到Eph家族的蛋白表達(dá)，而其他高度血管化的人體器官卻沒有Eph的表達(dá)。澳大利亞的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，將EphA3+ or EphA3-depleted eSCs和tumour-derived endothelial cells (TECs)共培養(yǎng)時(shí)，EphA3+ eSCs不僅有更多的大細(xì)胞簇（15個(gè)細(xì)胞以上組成的）并且有更多的細(xì)胞簇。在添加 IIIA4這種Eph活化劑的時(shí)候，EphA3+ eSCs的細(xì)胞簇的數(shù)量有顯著的降低。

Hypoxia-Controlled EphA3 Marks a Human Endometrium-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth

C. To, R. Farnsworth, M. Vail, C. Chheang, C. Gargett, C. Murone, C. Llerena, A. Major, A. Scott and P. Janes

PloS one, 2014, 10.1371/journal.pone.0112106

（一）實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1）細(xì)胞：  EphA3+eMSCs                                 6 ×103cell/well

           EphA3-eSCs                                    6 ×103cell/well

           tumour-derived endothelial cells (TECs)         1.2 ×104cell/well

2）試劑：  5 mg/ml Alexa647 human/mouse chimeric (ch)IIIA4 antibody 

           Alexa647 human Fc as control （Jackson ImmunoResearch)

           5 mg/ml EphA3-Fc

           4% PFA/0.2% glutaraldehyde

           DAPI

3）基質(zhì)膠：    Matrigel (ECMatrix, Millipore)                  10 µl per well

4）耗材：      µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506) 

5）儀器：      AF6000 LX microscope (Leica)    10x tile scan imaging 

6）其他：      細(xì)格紙                                             1 sheet 

1. 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1. 實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過第二天緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）

1. 開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
2. 打開滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。

1. 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：

由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

1. 凝膠

1. 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2. 準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
3. 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4. 將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。
5. 等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

1. 鋪細(xì)胞

• 按照1:2的比例準(zhǔn)備EphA3+eMSCs或EphA3-eSCs與tumour-derived endothelial cells (TECs)混合的細(xì)胞懸液（6 ×103cell/well：1.2 ×104cell/well）
• 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
• 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。
• 蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

1. 不同培養(yǎng)基處理

采用5 mg/ml Alexa647-IIIA4 antibody或Alexa647-Fc 或5 mg/ml EphA3-Fc或培養(yǎng)基分別加入血管生成載玻片中，37℃，培養(yǎng)多于18小時(shí)。

1. 采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果

采集圖像并且統(tǒng)計(jì)細(xì)胞簇個(gè)數(shù)和細(xì)胞簇內(nèi)細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖所示，EphA3+ eMSCs細(xì)胞簇比EphA3-eSCs細(xì)胞簇更大，更多，并且內(nèi)含15個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞簇也越多。

當(dāng)添加X-lkd IIIA4后，EphA3+ eMSCs細(xì)胞簇中大型細(xì)胞簇的比例有顯著的下降。