傷口愈合實(shí)驗(yàn)-干細(xì)胞侵襲

傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移的的一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個(gè)空白的無細(xì)胞的地帶，然后對(duì)這個(gè)無細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察；這些邊緣的細(xì)胞會(huì)開始進(jìn)行遷移活動(dòng)，并且終覆蓋整個(gè)無細(xì)胞的區(qū)域，重新互相接觸在一起。法國(guó)的科研人員在2015年的 STEM CELL上發(fā)的文章中提出神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體（proNGF）會(huì)自動(dòng)的激活乳腺癌干細(xì)胞，并且發(fā)生侵襲。文中，使用乳腺癌細(xì)胞系和腫瘤分離的細(xì)胞進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)，得出，由NGF處理的腫瘤離的乳腺癌細(xì)胞的傷口愈合速率有非常顯著的提高。說明在NGF能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移活動(dòng)。

Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment

E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis

STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849

在文中，使用Ibidi開發(fā)的傷口愈合插件進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗(yàn)。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養(yǎng)皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細(xì)胞種在插件中，等待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個(gè)無細(xì)胞的“劃痕”。

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 細(xì)胞:     MCF-7 、腫瘤分離細(xì)胞
• 實(shí)驗(yàn)耗材:   傷口愈合插件培養(yǎng)皿 (ibidi, 81176) 
• 細(xì)胞培養(yǎng)基:  MEM medium
• 試劑:  EGF  （sigma， E9644）

           bFGF （R&D，233-FB）

           NGF  （Scil Protein）

           proNGF （Alomone Labs，N-285）

• 滅菌鑷子

1. 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 鋪細(xì)胞（圖三）

• 將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。
• 在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入1 × 104的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。
• 在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。

圖三：A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。

1. 形成“劃痕”

• 采用無血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)
• 如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。 

• 移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。
• 小心的清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（圖五）。

1. 采集并分析圖像

• 在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向好是水平或者垂直。
• 采集0h和4h的圖像，并且分析每張圖的細(xì)胞覆蓋劃痕區(qū)的面積。

（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖所示，ML表示MCF-7 細(xì)胞系。腫瘤分離細(xì)胞團(tuán)分別由EGF、bFGF、NGF和proNGF處理，由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF處理的細(xì)胞，在4h的時(shí)候覆蓋面積大，遷移速率快。