全內(nèi)反射熒光顯微實(shí)驗(yàn)TIRF實(shí)驗(yàn)

整合素是一種跨膜蛋白，在介導(dǎo)細(xì)胞黏附到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。整合素在和配位體結(jié)合并發(fā)揮作用之前需要被激活。Kindlin和talin如何在非造血細(xì)胞中介入激活整合素這一過(guò)程的原理并不十分清晰。美國(guó)的科研人員發(fā)現(xiàn)缺少成纖維細(xì)胞，talin或kindlin都不能激活β1整合素，從而不能粘附到纖維粘聯(lián)蛋白表面上；甚至不能由Mn2+介導(dǎo)的整合素粘連構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變。使用Mn2+可以激活talin而不是kindlin缺陷細(xì)胞的部分整合素功能，使其活化和粘附在纖維粘連蛋白表面上。而具有方向性的粘附實(shí)際是由Kindlin直接誘導(dǎo)結(jié)合樁蛋白，可以反過(guò)來(lái)會(huì)粘附斑激酶（FAK）導(dǎo)致FAK活化并形成片狀偽足。這一研究結(jié)果表明，talin和Kindlin協(xié)同激活整合素與纖維粘連蛋白的結(jié)合，并隨后Kindlin會(huì)獨(dú)自形成一個(gè)特別的信號(hào)位點(diǎn)，形成新的蛋白粘附位點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中，采用talin和kindlin正常細(xì)胞核缺陷細(xì)胞作為樣本，對(duì)比各種細(xì)胞中整合素的分布，并且觀測(cè)加入Mn2+后，細(xì)胞行為的變化著整合素的分布。不僅采用了免疫熒光的方法進(jìn)行整合素的定位，并且在同一樣本中使用TIRF技術(shù)，準(zhǔn)確定位整合素的表達(dá)。

Elife. 2016 Jan 27;5:e10130. doi: 10.7554/eLife.10130.

Kindlin-2 cooperates with talin to activate integrins and induces cell spreading by directly binding paxillin.

Theodosiou M1, Widmaier M1, Böttcher RT1, Rognoni E1, Veelders M1, Bharadwaj M2, Lambacher A1, Austen K1, Müller DJ2, Zent R3,4, Fässler R1.

一、實(shí)驗(yàn)材料

1）細(xì)胞： Kind^ctr Cell （Kindlin正常對(duì)照細(xì)胞）

          Tln^ctr Cell  （talin正常對(duì)照細(xì)胞）

          Kind^ko Cell   (Kindlin缺陷細(xì)胞)

          Tln^ko Cell    (talin缺陷細(xì)胞)    

2）試劑： fibronectin（20 μg/ml, Calbiochem）

          4%多聚甲醛PBS溶液

          0.1% Triton X-100

          3%BSA

3）培養(yǎng)耗材：µ-Slide 8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理 （ibidi，Germany，80826）

二、實(shí)驗(yàn)方法

一）載玻片包被

①　每孔加入300μl 的  20 μg/ml的fibronectin溶液

②　室溫孵育60分鐘

③　吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用

二）免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1）鋪細(xì)胞，每孔鋪約100000個(gè)細(xì)胞

2）加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，靜置15分鐘

3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

5）依次加入一抗，二抗進(jìn)行免疫熒光染色后，沖洗小室并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察（圖二）。

圖二：圖示鋪細(xì)胞，固定，清洗，染色步驟。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖三：整合素在talin和kindlin缺陷細(xì)胞中的分布。A）共聚焦成像，顯示細(xì)胞腹部的β1整合素（綠色）和F-actin（紅色）在細(xì)胞中的分布。對(duì)比了有Mn²⁺存在或缺失的情況。B）共聚焦成像，顯示細(xì)胞腹部的9EG7定位結(jié)果。C）TIRF成像，顯示出β1整合素和柱蛋白的定位。D）TIRF-dSTORM采集的熱圖，顯示出局部整合素的密度。