活細(xì)胞骨架染色：實(shí)時(shí)觀察3D細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境與細(xì)胞遷移的互作用

2D細(xì)胞外基質(zhì)（ECMs）的物理特性會(huì)影響到細(xì)胞的粘附動(dòng)態(tài)和形態(tài)，但是3D細(xì)胞外基質(zhì)的局部微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響卻知之甚少。美國的科研人員構(gòu)建了幾種3D膠原基質(zhì)，研究其微結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于調(diào)節(jié)3D狀態(tài)下的細(xì)胞粘附動(dòng)態(tài)和細(xì)胞遷移的影響。細(xì)胞外基質(zhì)中有各種成束的纖維會(huì)加強(qiáng)局部可粘位點(diǎn)的堅(jiān)固性，并且可以通過ECM/粘附偶聯(lián)點(diǎn)增強(qiáng)細(xì)胞的粘附穩(wěn)定性，并且高度柔軟的網(wǎng)狀聯(lián)合促進(jìn)了粘附的收縮力。3D粘附的動(dòng)力學(xué)由局部的ECM的強(qiáng)度和整合素/ECM還有II型肌球蛋的收縮白共同調(diào)節(jié)。不同于2D遷移，3D的細(xì)胞遷移不僅受ECM孔徑大小影響。

科研人員需要觀察活細(xì)胞的在成束的纖維中細(xì)胞前沿的突出點(diǎn)的形態(tài)變化，和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的軌跡。使用LifeAct標(biāo)記細(xì)胞的F-actin能夠不影響細(xì)胞功能和行為的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會(huì)將細(xì)胞前進(jìn)的邊緣沿著成束的纖維長(zhǎng)邊移動(dòng)。具有接觸導(dǎo)向的作用，這一點(diǎn)在纖維和細(xì)胞前進(jìn)邊緣平行時(shí)尤為明顯。而纖維母細(xì)胞在不同的ECM中也顯示出了類似的特性，是將纖維拉向細(xì)胞自身的同時(shí)將偽足向前延伸，并遷移的。

Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions

Andrew D. Doyle，Nicole Carvajal, Albert Jin，Kazue Matsumoto& Kenneth M. Yamada

Nature Communications 6, Article number: 8720 doi:10.1038/ncomms

（一）實(shí)驗(yàn)材料

• 細(xì)胞:     fibroblast            （gift from NIDCR/NIH）
• 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質(zhì)粒    （ibidi， Germany）

             Phenol red-free DMEM      （Hyclone）

             FBS                        （Hyclone）

             L-glutamine           (GIbco)

             Anti-collagen I         ( Millipore,1:200, Cat# ABT-123)

• 儀器：   電轉(zhuǎn)儀                 (Bio-Rad Gene Pulsar TM)

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

  1、LifeAct-GFP轉(zhuǎn)染

 使用0.4cm的電擊杯，設(shè)定電壓為170V, 960uFd，持續(xù)時(shí)間17-22μs。

  2、collagen I 預(yù)染

• 5ml 的3mg/ml的collagen1在室溫固化
• 之后，膠置于50mM的硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）中孵育10min
• 室溫避光條件下使用灌流管逐漸用含有NHS脂染料的硼酸鹽溶液逐漸替換之前的緩沖液并孵育1小時(shí)。
• 保持染料一直處于灌流的狀態(tài)，并且在孵育用TRIS溶液沖洗10分鐘，并用PBS沖洗數(shù)小時(shí)移除沒有結(jié)合的染料
• 使用200mM的鹽酸溶解已凝固的膠知道所有的膠溶解
• 以1:1000的比例用20nM的冰醋酸透析上述膠溶液4小時(shí)
• 實(shí)驗(yàn)前，用標(biāo)記過的collagen I替換2-4%的未標(biāo)記的collagenI，并和細(xì)胞混勻，開始試驗(yàn)。

• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖所示：表達(dá)EGFP-LifeAct的fibroblast（綠色或灰色）在FB4 ECM（紅色）中的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。從時(shí)間序列的拍攝結(jié)果可以看出，細(xì)胞一直是沿著纖維的方向，將actin富集到細(xì)胞的絲狀偽足（白箭頭）中，控制細(xì)胞的遷移方向。星號(hào)代表了一條膠原纖維起止位置，青色的線作為其位置的參照物表明，細(xì)胞是通過將纖維拉向自己的方式來向前移動(dòng)的。