炎癥應(yīng)答和單核細(xì)胞的粘附實驗之環(huán)境模擬

愛爾蘭和瑞典科學(xué)家評估了一種抑制炎癥和平滑肌細(xì)胞增殖的新的藥物洗脫支架的治療效率。在這項研究中，科學(xué)家用CX3CR1作為靶向受體，用于預(yù)防單核細(xì)胞的粘附和炎癥反應(yīng)。使用AZ12201182（AZ1220），一種CX3CR1的拮抗劑，處理單核細(xì)胞；并且在流體狀態(tài)下，將AZ1220處理的單核細(xì)胞的在CX3CR1表面的粘附效率和沒有任何處理單核細(xì)胞的粘附效率進(jìn)行對比觀測。更進(jìn)一步，還研究了用AZ1220處理和沒處理的單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附效率。

Biomaterials. 2015 Nov;69:22-9. doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.07.059. Epub 2015 Aug 3.

A novel CX3CR1 antagonist eluting stent reduces stenosis by targeting inflammation.

Ali MT1, Martin K1, Kumar AH1, Cavallin E2, Pierrou S3, Gleeson BM1, McPheat WL2, Turner EC1, Huang CL1, Khider W1, Vaughan C4, Caplice NM5.

一、實驗準(zhǔn)備實驗材料及設(shè)備

1）細(xì)胞： Porcine peripheral blood monocytes               

2）試劑：Biocoll separating solution （Cat No. L6113, Biochrom,Germany）

         Monocyte Isolation Kit II   （Monocyte Isolation Kit II）

         100 nM CX3CL1 （Cat No. 365-FR-025, R&D Systems, USA）

         Cell Tracker Orange  (Cat no. C2927, Life Technologies)

         RPMI medium (Cat No. R7638, Sigma)

         lipopolysaccharide (Cat No. L2630, Sigma)  

3）培養(yǎng)耗材：ibidi六通道載玻片μ-Slide VI Luer （ibidi，Germany，80606）

             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）

             封口夾

1. 儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

二、實驗方法

在實驗開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置第二天，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

一）滾動粘附實驗設(shè)計：

• 用100 nM CX3CL1/或60000個/通道的內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)包被或預(yù)鋪在6通道載玻片
• 六通道內(nèi)細(xì)胞要使用lipopolysaccharide活化6小時
• 1×10⁵ cells/cm²密度的細(xì)胞（加入AZ1220，對照為不加入AZ1220）放入灌流管中
• 連接6通道載玻片到ibidi流體剪切力系統(tǒng)上，以0.5dyn/cm2 (50mPa) 開始實驗。
• 15分鐘在一個通道中不同位置采集5張圖片，之后換通道再拍

二）搭建流體系統(tǒng)

1）將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入含細(xì)胞的12ml培養(yǎng)基。這時不需要連接通道載玻片。實驗前需要去除整個灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會影響剪切力的大小，有時還會使灌流系統(tǒng)中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）

2）連接通道載玻片（本次實驗是用6通道載玻片，但每次實驗只連接一個通道，所以這里使用單通道載玻片為例）。去除氣泡后，就可以將之前準(zhǔn)備好的含貼壁細(xì)胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下，放到超凈臺中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過滿狀態(tài)(）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖一）。

圖一：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀測一下通道內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)。

3）檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲液管液面不會下降或者上升，那么，整個系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的（圖二）。

圖二

三 實驗結(jié)果

如圖所示：AZ1220在流體狀態(tài)下抑制了單核細(xì)胞粘附CX3CL1。AB）在剪切力0.5dyn/cm2刺激下對比AZ1220的影響。流動15分鐘后采集圖片，并進(jìn)行統(tǒng)計，單核細(xì)胞用 Cell Tracker Orange標(biāo)記。CD）單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞的粘附結(jié)果。兩種粘附實驗的結(jié)果均說明，隨著AZ1220的濃度上升，單核細(xì)胞在CX3CL1的粘附性下降。